1 / 42

Kinetika

Kinetika. Specifičnost enzimske katalize. 1. Koliziona teorija 2.Teorija prelaznog stanja. G. O snovne jedna čine termodinamike : D G = - RT lnK. D G = D H - T D S Prelazno i osnovno stanje su u termodinamičkoj ravnoteži.

elisha
Download Presentation

Kinetika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Kinetika

  2. Specifičnost enzimske katalize

  3. 1. Koliziona teorija2.Teorija prelaznog stanja G Osnovne jednačine termodinamike : DG = - RT lnK DG = DH - T DS Prelazno i osnovno stanje su u termodinamičkoj ravnoteži Povezuje brzinu reakcije sa razlikom slobodnih energija osnovnog i prelaznog stanja - poredjenje relativnih reaktivnosti parova supstrata - poredjenje brzina pri različitim reakcionim uslovima

  4. Male promene DG‡ – velike promene u V reakcije: DDG ‡od 5,71 kJ/mol => 10 V DDG ‡od 34,25 kJ/mol => 106V Na koji način enzimi smanjuju DG ‡?

  5. Hammond-ov postulat i Hammond-ov efekat • Ukoliko postoji nestabilni intermedijer, prelazno stanje će da podseća na njega. • Unimolekularne reakcije • Brønsted-ova b vrednost DDG ±/DDG G

  6. Kinetičkim studijama se dobijaju parametri koji karakterišu jedan enzim: odredjuju se afinitet vezivanja supstrata za enzim, kao i maksimalna brzina • Kombinovanjem podataka dobijenih kinetičkim studijama i strukturnom analizom, dolazi se do mehanizma delovanja enzima • Kinetičke osobine enzima kao konstituenta celovitijeg metaboličkog procesa odredjuju njegovo mesto u ukupnom metabolizmu • Enzimska aktivnost može biti i indikator patoloških stanja: Biohemijska klinička slika se dobija odredjivanjem aktivnosti odredjenih enzima • Enzimi su našli široku primenu u industriji

  7. Molekularnost – koliko reaktanata ucestvuje u reakciji • n-red reakcije: zavisnost brzine od koncentracije odredjenog reaktanta

  8. Integracijom jednačine brzine dobijaju se izrazi koji pokazuju promenu koncentracija reaktanata ili proizvoda kao funkciju vremena.

  9. Reakcije drugog reda

  10. Odredjivanje početne brzine reakcije

  11. Brzina: promena koncentracije reaktanata u vremenu. • Reakciona brzina koja se odredjuje u kinetičkim eksperimentima odgovara početnoj brzini reakcije (vi, vo). • Sprečava se efekat povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi na minimum. • 5 %

  12. Enzim postaje nestabilan tokom reakcije • Stepen zasićenja enzima supstatom se smanjuje sa tokom reakcije usled nestanka (konverzije) supstrata • Efekat povratne reakcije predominira sa akumulacijom proizvoda • Proizvod reakcije inhibira enzim • Promena reakcionih uslova usled promene pH

  13. Enzimima katalizovane reakcije se ne uklapaju u standarne kinetičke modele homogenih hemijskih reakcija!

  14. Početna brzina • Reakciona brzina koja se odredjuje u kinetičkim eksperimentima odgovara početnoj brzini reakcije (vi, vo). • Sprečava se efekat povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi na minimum. • 5 %

  15. U početku reakcije enzim je najstabilniji • Brzina reakcije je kinetički kontolisana enzimom (linearna zavisnost brzine od koncentracije enzima) • One-time measurement (jedno vreme, više koncentracija S) • Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja) • Koje vreme koristiti? • Koju koncentraciju supstrata?

  16. One-time measurement (jedno vreme, više koncentracija S) • Enzim mora da bude stabilan tokom toka reakcije • Mere se početne brzine reakcije • Brzina reakcije mora da bude proporcionalna koncentraciji enzima

  17. - Poluzasićenje -         Brzina enzimske reakcije postiže zasićenje kada je koncentracija substrata toliko visoka da su sva aktivna mesta zauzeta (maksimalna brzina – Vmax). -         Poluzasićenje enzima substratom je ona konc. substrata kada se postiže 50 % Vmax (Km – merilo afiniteta enzima za odgovarajući substrat) Poznavanje vrednosti Km za dati sistem je moguće ukoliko se poznaje Vmax ili nakon serije eksperimenata za odredjivanje brzine za različite konc. substrata i »fitovanja« tih podataka u jednačinu koja opisuje oblik ove krive prema nepoznatim vrendostima (Km i Vmax). Koju jednačinu koristiti... Nekoliko hemijskih kinetičkih modela daje slične jednačine oblika: Y = aX/(b+X)

  18. Mihaelis-Menten-ova jednačina

  19. Mihaelis-Menten-ov mehanizam Enzim-supstrat kompleks je u ravnoteži sa slobodnim enzimom i supstratom ES kompleks – Mihaelisov kompleks Ks – konstanta disocijacije ES kompleksa Korak koji odredjuje brzinu reakcije je raspad kompleksa ES na E i P

  20. Brigs-Haldan-ov mehanizam Uvode pojam ravnotežnog stanja: ukoliko je brzina reakcije konstantna u odredjenom vremenskom intervalu, i koncentracija ES je takodje konstantna Km = (k2 + k-1)k1 Ks = k-1/k1 Km = Ks + k2/k1

  21. Km: 10-1 – 10-7 M

  22. kcat je konstanta prvog reda koja se odnosti na osobine i reakcije ES, E-intermedijer i EP • Km: prividna konstanta disocijacije koja se moze smatrati opštom konstantom • disocijacije za sve komplekse koje gradi E • Značenje kcat/Km: konstanta specifičnosti; odnosi se na svojstva i reakcije • slobodnog enzima i slobodnog supstrata

  23. Linearni oblici Mihaelis-Menten-ove jednačine Lineweaver-Burk Hanes Eadie-Hofstee Distribucija greške za različite metode linearizacije

  24. Konstanta specifičnosti

  25. Integralni oblik MM jednačine Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja)

  26. Odredjivanja enzimskih aktivnosti • Optimalni uslovi • Prisustvo supstrata • Prisustvo kofaktora • Kinetička odredjivanja • Kinetički parametri

  27. Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) • Specifična aktivnost (U/mg) • Koncentracija enzimske aktivnosti U/mL • Turnover number, molekulska aktivnost (1/min, 1/s) • Aktivnost katalitičkog centra (kcat)

  28. Prečišćavanje enzima -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti -         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina -         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena -         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.) -         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći Neke osnovne definicije: • Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*. • 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti.Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg proteina. *Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće: -         Temperatura 30 oC -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)

  29. Katalitička antitela se ili prave na analoge prelaznih stanja, ili selektuju prema katalitičkoj aktivnosti. Daleko su manje efikasna od odgovarajućih enzima

More Related