Kinetika

1. Kinetika

2. Mihaelis-Menten-ova jednačina

3. Mihaelis-Menten-ov mehanizam Enzim-supstrat kompleks je u ravnoteži sa slobodnim enzimom i supstratom ES kompleks – Mihaelisov kompleks Ks – konstanta disocijacije ES kompleksa Korak koji odredjuje brzinu reakcije je raspad kompleksa ES na E i P

5. Brigs-Haldan-ov mehanizam Uvode pojam ravnotežnog stanja: ukoliko je brzina reakcije konstantna u odredjenom vremenskom intervalu, i koncentracija ES je takodje konstantna Km = (k2 + k-1)k1 Ks = k-1/k1 Km = Ks + k2/k1

7. Linearni oblici Mihaelis-Menten-ove jednačine Lineweaver-Burk Hanes Eadie-Hofstee Distribucija greške za različite metode linearizacije

8. Km: 10-1 – 10-7 M

10. Konstanta specifičnosti

11. Mehanizam sa intermedijerima

12. kcat je konstanta prvog reda koja se odnosti na osobine i reakcije ES, E-intermedijer i EP • Km: prividna konstanta disocijacije koja se moze smatrati opštom konstantom • disocijacije za sve komplekse koje gradi E • Značenje kcat/Km: konstanta specifičnosti; odnosi se na svojstva i reakcije • slobodnog enzima i slobodnog supstrata

13. Prolazna vremena vs. konstante brzine Enzimske reakcije koje uključuju više intermedijera! (Himotripsin) Briggs-Haldan-ov mehanizam Prolazna vremena su aditivna.

14. Integralni oblik MM jednačine Krive progresa reakcije (jedna konc. S više merenja)

15. Enzim mora da bude stabilan tokom čitavog merenja • Povratna reakcija mora da bude zanimarljiva • Proizvod ne sme da inhibira enzim

16. Kompetujući supstrati

17. Specifičnost prema kompetujućim supstratima

18. Haldanova jednačina Da li ravnoteža u reverzibilnim enzimima katalizovanim reakcijama zavisi od prisustva enzima?

19. Ravnoteža na površini enzima Ravnotežne konstante na površini enzima su drugačije od konstanti u rastvoru. Razlozi: 1. napon; 2. neproduktivno vezivanje; 3. entropijski faktor

20. Inhibicije • Izučavanje složenih metaboličkih puteva • Izučavanje složenih multisupstratnih reakcija • Enzimske inaktivacije i zdravlje (trovanje i lekovi) • Tipovi inhibicije: • reverzibilna (kompletna i parcijalna) i • ireverzibilna (inaktivacija) • Tipovi reverzibilne inhibicije: • Kompetitivna • Antikompetitivna • Mešovita • Nekompetativna

22. Kompetitivna inhibicija Inhibitor (I) i supstrat se vezuju za isto mesto na enzimu Jednostavni MM mehanizam Km se menja, ali ne i Vmax

25. Linearizovani oblici MM jednačine za kompetitivnu inhibiciju

26. Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju kompetitivne inhibicije LB metodom

27. Akompetitivni tip inhibicije • Inhibitor se vezuje za kompleks ES, ali ne i za slobodan enzim • Uspostavlja se ravnotežno stanje, pri čemu je kompleks ESI u ravnoteži sa ES

29. Linearizovani oblici MM jednačine za ampetitivnu inhibiciju

30. Sekundarni grafik za odredjivanje Ki u slučaju akompetitivne inhibicije LB metodom

31. Mešovita inhibicija (specijalni slučaj – nekompetitivna inhibicija)

33. Linearizovani oblici MM jednačine za mešovitu inhibiciju

34. Sekundarni grafici za određivanje Ki i Ki’ u slučaju mešovite inhibicije LB metodom

35. Nekompetitivna inhibicija *Inhibitor utiče samo na katalitičku funkciju enzima, ali ne i na vezivanje supstrata *Važan tip inhibicije za multisupstratne enzime *Pri niskim koncentracijama S, efekat inhibitora se može zanemariti

36. Linearizovani oblici MM jednačine za nekompetitivnu inhibiciju

37. Sekundarni grafici za određivanje Ki i u slučaju nekompetitivne inhibicije LB metodom

39. Efekti različitih inhibitora na parametre u MM jednačini Km app. Km aKm Km/a’ * aKm/a’ *Specijalan slučaj: a = a’, nekompetitivna inhibicija, Km se ne menja, Vmax se smanjuje za faktor a’

40. Odstupanje od MM jednačine Inhibicija (aktivacija) supstratom

41. Neproduktivno vezivanje Km i kcat se smanjuju Km je manje od Ks Važi i za reakcione mehanizme u kojima nastaju intermedijeri!

45. `=

46. Praktični aspekti određivanja u enzimologiji • Odredjivanja enzimskih aktivnosti • Optimalni uslovi • Prisustvo supstrata • Prisustvo kofaktora • Kinetička odredjivanja • Kinetički parametri

49. Enzimska aktivnost (IU ili U, Katal) • Specifična aktivnost (U/mg) • Koncentracija enzimske aktivnosti U/mL • Turnover number, molekulska aktivnost (1/min, 1/s) • Aktivnost katalitičkog centra (kcat)

50. Prečišćavanje enzima -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti -         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina -         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena -         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.) -         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći Neke osnovne definicije: • Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*. • 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti.Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg proteina. *Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće: -         Temperatura 30 oC -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)