Virusneutralizace v diagnostice chřipkové infekce

1. Virusneutralizace v diagnostice chřipkové infekce Martina Havlíčková

2. Chřipka-nejpoužívanější testy • KFR rutinně zavedená ve většině laboratoří, typově specifická, výborné zkušenosti u pandemie • HIT pouze některá pracoviště, subtypově a variantně specifický • VNT dostupný zpravidla jen v NRL citlivější než HIT, reaguje širší spektrum protilátek než u HIT • ELISA , IF • SRHT specifický test, pouze pro některé účely ve vakcinologii stanoveny parametry pro práh pozitivity/protekci komerční sety, u IF nutná zkušenost s hodnocením

3. Virusneutralizace • Měří celé spektrum protilátek, které mají neutralizační schopnosti • Proto je citlivější než HIT a KFR ALE: • Nutnost práce s živým virem • Virus musí mít dobré růstové vlastnosti v tkáňové kultuře – TCID50 minimálně 10-4 • Test musí být optimálně vyvážen, vzhledem k jisté nestabilitě kultivačního systému není příliš robustní • Nezbytný systém standardních pozitivních i negativních kontrol

4. Různé metodiky • Očkování na buněčný monolayer • Očkování přímo do suspenze buněk • tento dvojí přístup nemusí být stejně citlivý, především co do výše infekčního titru viru, který je pro reakci použit • Redukce plaků • Reakci významně ovlivňuje i kvalita a složení příslušného kultivačního média • Vizualizace výsledků: • ELISA in situ • Hemaglutinace • oba přístupy porovnatelné, HA jednodušší a rychlejší • Mikroskopické posouzení inhibice hemadsorpce • Posuzování CPE není u chřipky vhodné • Redukce plaků – pro širší využití nevhodné, striktně závislé na na schopnosti´použitého viru plakovat

5. Metodika používaná v NRL • Adaptována dle Rowe a spol. 1999 • Inaktivovaná a vytitrovaná séra byla smíchána s virem v koncentraci 2x103 TCID50 • 2 hodiny inkubace při 37°C v 5% CO2 atmosféře • Přidána buněčná suspenze v koncentraci 350 000 buněk /ml • Inkubace 48 hodin • HA test pro hodnocení replikace viru/inhibice replikace

6. Vyvažování testu

7. Porovnání geometrických průměrů titrů protilátek proti viru pandemic H1N1 2009 v akutním a rekonvalescentním vzorku séra pomocí tří základních sérologických metod – KFR, HIT a VNT u 40 pacientů s PCR prokázanou infekcí

8. KFR

9. k provedení reakce je nejvhodnější virus s vysokým TCID50, aby test měl dostatečnou robustnost • existuje více systémů testu, více médií a protokolů • při vhodném nastavení jsou porovnatelné • interpretace testu velmi záleží na nastavení kontrol, vyšetření každého vzorku ve dvojici je nutné • korelace mezi HIT titrem a VNT titrem není pevná • i relativně nízké titry v HIT (1:20) mohou mít ve VNT vysoký titr (1:80-1:160) • nízké VNT titry (1:10-1:20) nejsou pravděpodobně vždy specifické a tvoří pouze pozadí reakce • protektivní titr ve VNT – 1:80…. spíše 1:160 • nutné stanovit, ani v metodice WHO není deklarován

10. Úskalí a nesnáze • Dynamika jednotlivých testů nemusí být ve shodě, protože každým měříme odlišné spektrum protilátek • V případě výrazné diskrepance mezi nálezy (např. výtěr PCR pozitivní, HIT nebo KFR negativní, ) lze situaci zpravidla verifikovat pomocí VNT • IgM a IgA protilátky – doplňující význam, negativita nálezu v žádném případě nevylučuje proběhlou či probíhající infekci

11. Kdy je VNT vhodná aneb co od vyšetření očekáváme? • potvrzení již stanovené diagnózy (PCR pozitivita ve výtěru) • alespoň částečné vodítko pro terapii?? • diferenciálně diagnostický údaj?? • momentální stav protilátek proti danému viru (variantě) – sérologický přehled)  • Citlivé zhodnocení vývoje protilátek ve dvojici séra • Vyšetřování v pandemické situaci, průkaz protilátek proti novému viru