1 / 35

Cilj nastave :

Cilj nastave :. Principi LDg PGI : dlake nokta kože sluzokože oka uva. 2. Principi LDg IGI: aglutinacija , precipitacija , ELISA, PCR, PH invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija. 3. Metode identifikacije gljiva

leanne
Download Presentation

Cilj nastave :

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Cilj nastave: • Principi LDg PGI: • dlake • nokta • kože • sluzokože • oka • uva 2.Principi LDg IGI: aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH • invazivna aspergiloza (IA) • invazivna kandidijaza (IC) • zigomikoze • Pneumocystis pneumonija 3. Metode identifikacije gljiva Metode ispitivanja osetljivosti gljiva na AM • Difuzija • Dilucija • Etest 4. Epidemiologija GI Rizične grupe pacijenata Endemske GI (bifazne i subkutane mikoze) Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze

  2. OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE GI STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE (KONVENCIONALNE METODE) 1. MIKROSKOPSKI PREGLED BOLESNICKOG MATERIJALA • direkni mikroskopski preparat(DMP) • patohistologija (PH) 2. IZOLACIJA GLJIVA IZ BOLESNICKOG MATERIJALA • mikolo š ka kultura (MK) IMUNOLOŠKE METODE DOKAZIVANJE ANTITELA (At) DOKAZIVANJE ANTIGENA (Ag) DOKAZIVANJE BIOMARKERA MOLEKULARNE METODE DOKAZIVANJE DNK (PCR) DOKAZANA GI VEROVATNA/MOGUĆA GI “z l a t n i s t a n d a r d”

  3. OSNOVNI PRINCIPI LABORATORIJSKE DIJAGNOZE IGI“non culture” metode – izbor za LDg IGI STANDARDNE MIKOLOŠKE METODE (KONVENCIONALNE METODE) • HEMOKULTURA NA GLJIVE • BIOPSIJA IMUNOLOŠKE METODE DOKAZIVANJE At DOKAZIVANJE Ag gljiva DOKAZIVANJE BIOMARKERA MOLEKULARNE METODE DOKAZIVANJE DNK (PCR) Problem: retko pozitivne, invazivna metoda uzorkovanja, spore Prednost: Rana Dg IGI Senzitivne Brze Prednost:Rana Dg IGI Visoko senzitivne Brze Prednost: DOKAZANA IGI Problem: interpretacija nalaza At kod imunodeficijentnih osoba Problem: lako moguća kontaminacija uzoraka Nisu standardizovane

  4. Nova strategija dijagnoze IGI* tkivo Faktori domaćina Klinička slika Mikologija + + = Dokazana IGI Faktori domaćina Klinička slika Mikologija + + = Verovatna IGI Faktori domaćina Klinička slika Negativna Nije radjena + = Moguća IGI Faktori domaćina Mikologija Negativna + = *EORTC/MSG kriterijumi

  5. Idealan dijagnostički test Senzitivan i specifičan Visoka pozitivna prediktivna vrednost (PPV) Visokanegativna prediktivna vrednost (NPV) Jednostavan Jeftin Brz

  6. Zašto “non cultural” metode (detekcija biomarkera)??? Principi testova

  7. Zašto biomarkeri? • Antigeni and antitela se lakše otkrivaju nego • same gljive Antitela se produkuju u velikoj količini i cirkulišu Solublni Ag gljiva često prolaze iztkivau cirkulaciju Solublni Ag gljiva se nalaze i u urinu Solublni Ag gljiva se mogu detektovati i kada su male količine Kultura na gljive ima nisku senzitivnos: zbog malog broja gljiva u tkivu ili krvi – neophodan veći broj uzoraka

  8. Biomarkeri gljiva i “non culture” metode Strukture gljiva Candida Aspergillus Metode Mannans 1,3--D-glucans chitin Galactomannan 1,3--D-glucans chitin LA ELISA RIA Amebocid lizat Spectrofotometrija Ćelijski zid Citoplazmatska membrana Enolase HSP-90 ELISA Immunoblot Metaboliti arabinitol D-mannitol GLC Mas. spektroskop. DNK/RNK C-14 lanosterol demethylase Chitin synthase Actin Aspartate proteinase Ribosomal RNA C-14-lanosterol demethylase Alkaline protease Mitochondrial DNA HSP-90 Ribosomal RNA genes PCR

  9. “Non cultural” metode (aglutinacija, imunodifuzija, ELISA) Principi Ag-At testova

  10. Lateks aglutinacija (LA) – princip testa + Latex obložen At Uzorak (+) Ag gljiva Antibody Test + Latex obložen Ag Uzorak (+) At na gljiva Antigen Test Aglutinat Aglutinat

  11. Lateks aglutinacija (LA) – primena *Invazivnaaspergiloza ** Invazivnakandidijaza LA – interpretacijanalaza Primena testa – detekcija Ag: Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA*) Manan – Candida Ag (IK**) Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag Primena testa – detekcija At: Anti-galaktomanan-At Anti-manan-At Anti-glukuroksilomanan-At

  12. Imunodifuzija (ID) – princip testa Immunobiology, 4th Edition

  13. Imunodifuzija (ID) - princip testa Concentration

  14. Imunodifuzija (ID) - princip testa Concentration

  15. Imunodifuzija (ID) - princip testa Kuby Immunology, 4th Edition

  16. Imunodifuzija (ID) - princip testa Kuby Immunology, 4th Edition

  17. Imunodifuzija (ID) - princip testa Kuby Immunology, 4th Edition

  18. Imunodifuzija (ID) – primena Pozitivannalaz - precipitacija Primena: aspergiloza (Ag, IgG) subkutane mikoze (Ag, IgG) endemske mikoze (Ag, IgG)

  19. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva Sandwich ELISA Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  20. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva Sandwich ELISA Add Specimen Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  21. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag gljiva Sandwich ELISA Add Specimen Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  22. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)princip testa - detekcija Ag Sandwich ELISA Add Specimen Containing Ag Primena testa: • Galaktomanan – Aspergillus Ag (IA) • Manan – Candida Ag (IK) • Glukuroksilomanan – Cryptococcus Ag Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  23. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  24. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At (Specimen) Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  25. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija Ag (Specimen) Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

  26. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)Princip testa - detekcija At Primena testa: • anti-Aspergillus IgA, IgM, IgG, IgE(IA, aspergilom, ABPA, astma) • anti-Candida(IK) IgA, IgM, IgG • anti-Cryptococcus IgM, IgG • Specifična At pri sumnji na endemske mikoze

  27. “Non cultural” metode (PCR) Principi PCR testa

  28. PCR ZA DIJAGNOZU IGI NIJE STANDARDIZOVAN!!! Uzorci: • krv • serum • tkivo • BAL • CSF Protokoli • DNK ekstrakcije • PCR dizajn • Amplifikacije Species/genus specifične sekvence • HSP 90 • Lanosterol • demethylase • chitin synthase • aspartic proteinase • actin Primena: Aspergiloza Kandidijaza Pneumocistis pneumonija

  29. Automatizovan metodizdvajanja DNKgljiva iz krvi Ekstrakcija DNK • Automatizovana • Trajanje testa 16 h - 4h • In vitroosetljivost (1cfu/ml) Kontaminacija (problem) • tokom ekstrakcija • tokom izvođenje testa • tokom priprema proba • tokom priprema reagenasa Okolina!!!

  30. Metode patohistologije u dijagnozi IGI Specijalna bojenja na gljive

  31. GLJIVE - specijalna bojenja (HP) Gomori methenamin silver (GMS): Prednost: dobra vizuelizacija gljiva Gljive: tamno braon – osnova zelena H&E: Prednost: dobrodetektuje zapaljenski odgovor Nedostatak: loša vizuelizacija gljiva Periodic acid-Shiff (PAS): Prednost: dobra vizuelizacija gljiva Gljive: crvene ili ružičaste – osnova zelena Mucin (mucicarmin): Prednost: dobra vizuelizacija kapsule gljiva Kapsula: ružičasta – osnova sivo-roze Fontana-Masson: Prednost: dobra vizuelizacija ĆZ gljiva i melanina Gljive/melanin: tamnobraon – osnova svetla

  32. Gljive – histopatologija (HP) GMS H&E Hope et al., Lancet Infectious Diseases5: 609, 2005

  33. Gljive – histopatologija (HP) Pluća (PAS) Pluća (mucikarmin)

  34. Gljive – imunohistopatologija (IHP) Imunohistohemija (mAt) WF-AF-1 (Dako) EB-A1 (Dako) Choi JK, Am J Clin Pathol121: 18, 2004

  35. Pneumocystis jirovecii - Gimza Mikroskopski nalaz oktetnih cisti (400X) BAL, biopsija plućnog tkiva

More Related