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Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie

Molekularbiologische Aspekte beim Prostatakarzinom (PCa) - Grundlagen der Entstehung sowie Möglichkeiten der Diagnostik und Therapie. Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Direktor Prof. Dr. M. Wirth TU-Dresden. Histologie des Prostatakarzinoms.

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  1. Molekularbiologische Aspekte beim Prostatakarzinom (PCa) - Grundlagen der Entstehung sowie Möglichkeiten der Diagnostik und Therapie Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Direktor Prof. Dr. M. Wirth TU-Dresden

  2. Histologie des Prostatakarzinoms

  3. Regulation des Prostatawachstums Androgene Wachstumsfaktoren stromal-epitheliale Interaktion

  4. Genexpression in der Prostata Testosteron (T) Dihydrotesto- steron (DHT) DHT T AR 5-a Re- duktase Gen HRE RE ZK Promotor TGF-b EGF, KGF - + Epithelzelle

  5. Veränderungen der Prostata Unkontrolliertes Wachstum von Prostata- zellen meist erst ab dem 50. Lebensjahr Benigne Hyperplasie (BPH) Prostatakarzinom (PCa)

  6. Inzidenz des PCa häufigste Tumorerkrankung beim Mann in der westlichen Welt ca. 250.000 Neuerkrankungen p.a. steigende Inzidenz mit dem Alter insignifikantes PCa bei ca. 20-30% aller Männer über 50

  7. PCa - Tumorstadien Stadium 5-Jahres- Überlebensrate lokal begrenzt 99,1% (T1/T2) lokal fortgeschritten 93,6 % (T3/T4) metastasierend 30,7% (N1, M1)

  8. Grundlagen Molekulare Ursachen der Entstehung eines PCa familiäre/hereditäre Ursachen chromosomale Veränderungen (Deletionen, Translokationen, Mutationen) Methylierung Differentielle Genexpression

  9. Grundlagen Familiäres Prostatakarzinom unter 65 Jahren: 5-10% familiär bedingt unter 65 Jahren, mind. 4 Betroffene pro Familie: 25-30 % familiäre Ursache prostate cancer susceptibility loci 1q 24-25 (HPC-1) 1p 36 (PCa, Hirntumoren)

  10. Grundlagen Chromosomale Verluste beim PCa (CGH, LOH) 16q E-Cadherin 5q a--Catenin 13q RB, BRCA2 10q PTEN % Verlust Chromosomale Region

  11. Grundlagen Methylierung beim PCa Inaktivierung von Genen durch Methylierung von CpG-reichen Sequenzen im Promotor CpG GST-1/AR 5‘ regulatorische Sequenz Zielgen Gluthathion S-Transferase (GST-1) Androgenrezeptor (AR)

  12. Grundlagen Onkogene und Tumorsup-pressorgene beim PCa Onkogene ras c-myc c-erb-2 bcl-2 Tumorsuppressorgene p53 Retinoblastom-Gen BRCA2 KAI1

  13. Grundlagen Tumorfrei Tumor Differtielle Genexpression Methode:DD-PCR (Differential Display PCR) Amplifizerung von cDNA-Fragmenten des Tumor- und tumorfreien Gewebes TAAA GAAA mRNA CAAA GTTT cDNA CAAA PCR

  14. Grundlagen Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens C13 Chromosom 13q13 Lokalisierung zwischen den Tumor- suppressorgenen BRCA2 und Rb-1 Kernlokalisierungssignal Ähnlichkeit zu Transkriptionsfaktoren epithelspezifische Expression Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  15. Grundlagen Untersuchungen zum Verlust der Heterozygotie Methode:Untersuchung von Allelverlusten mit Mikrosatellitenmarkern bei Tumor- und tumorfreiem Gewebe Allel 1 ACACAC Allel 2 ACACACAC PCR tumorfrei Tumor

  16. Grundlagen C13-LOH-Analysen 5 Mikrosatellitenmarker im Bereich 13q13 LOH oder AI: 61 % (13 von 21 Patienten) Unterstützung der Hypothese, daß C13 ein Tumorsuppressorgen ist BRCA2 C 13 13 RB1 Chromosom 13 Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  17. Grundlagen Weitere Gene involviert in die Prostatakarzinogenese Telomerase angiogene Wachstumsfaktoren Gene der Apoptose CD 44

  18. Grundlagen Faktoren der Metastasierung Zell-Adhäsionsmoleküle E- Cadherin a- Catenin Metalloproteinasen und Inhibitoren MMP TIMP Angiogene Faktoren VEGF und Rezeptoren

  19. Grundlagen Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens Cyr 61 Chromosom 1p22 verminderte Expression im PCa-Gewebe epithelspezifisch extrazelluläres Signalprotein, matrixgebunden Modulator der Zelladhäsion und Zellinteraktion Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  20. Diagnostik Diagnostik beim PCa Primärdiagnostik: Digitale rektale Untersuchung Serum-PSA Bestimmung transrektaler Ultraschall Histologie der Biopsien Metastasierung: Skelettszinthigraphie CT Thorax und Abdomen (PET)

  21. Diagnostik Verbesserte Diagnostik Verbesserung der Primärdiagnostik bei Serum-PSA 4-10 ng/ml Verbesserung von Staging und Prognose sensitiver molekularer Nachweis von PCa-Zellen in Blut, Biopsien, regionären Lymphknoten

  22. Diagnostik Nachweis von PCa-Zellen mittels RT-PCR Bestimmung der Menge an PCa-Zellen (Staging) Feststellung der Ex- pression spez. Tumor- marker (Prognose) Aufschluß des Gewebes Isolierung der Gesamt-RNA Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR

  23. Diagnostik Qualitative und quantitative Bestimmung von Transkripten Tumorspezifische Transkripte Prostataspezifische Transkripte Telomerase c-src Survivin Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) Somatostatin-Rezeptor Typ 1 Prostata spezifisches Antigen (PSA) Prostata spezifisches Membranantigen (PSM) Humanes Kallikrein (hK2)

  24. Diagnostik Prostataspezifische mRNA‘s PSM (Prostata Spezifisches Membranantigen) PSA (Prostata Spezifisches Antigen) Serinprotease Lokalisation: Serum Größe: 34 kDa Transkripte: PSA mRNA Folathydrolase Lokalisation: Plasmamembran Größe: 94 kDa Transkripte: PSM mRNA PSM’ mRNA PSM’’ mRNA

  25. Qualitativer Nachweis von PSM-Transkripten in Lymphknoten 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1-3, 5-7: Lymphknoten RNA 8: pos. Kontrolle (LNCaP RNA) 9: neg. Kontrolle 10: 123 bp DNA-Standard Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  26. Diagnostik 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Wasser Standard 10 pg Standard 1 pg Standard 100 fg Standard 10 fg Quantitativer Nachweisvon PSA-Transkripten 1.0 Fluoreszenz 0.10 Anzahl der Zyklen pos. PCa-Zellen Patient 1 LK Patient 2 LK Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  27. Diagnostik Nachweis von PSA-Transkripten in regionären Lymphknoten n RT-PCR- RT-PCR- PSA + PSM RT-PCR- PSM‘ PCa/N+ 17 12 16 15 PCa/N- 37 0 35 37 PCa 54 12 51 32 RCC 3 0 3 2 kein Ca 2 0 0 0 Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  28. Therapie Therapie des PCa Operation - radikale Prostatektomie Hormontherapie Strahlentherapie

  29. Therapie Molekulare Grundlagen der Hormonresistenz Androgenrezeptor Steroidrezeptoren EGF-Rezeptor MDR-1 (Multi-Drug Resistenz-Gen)

  30. Therapie Molekulare Therapie- ansätze für das PCa Inhibitoren von Wachstumsfaktoren Anti-Angiogene Faktoren Gentherapie

  31. Therapie Shc Signalkaskade desEGF-Rezeptors EGF EGF EGF-Rezeptor Ras SOS Raf Kinase Kinase GRB2 c-src Mitogenese c-myc PLCy MEK MAPK c-fos Ziel-Gen c-jun

  32. Therapie Gentherapeutische Ansätze beim PCa Immun-Gentherapie Suizidgentherapie Inhibierung von Onkogenen Expression von Tumorsupressorgenen

  33. APC Immun-Gentherapie mit Antigen Präsentierenden Zellen (APC) Adenoviraler Gentransfer (PSA, PSM) Antigen expr. APC’s + GM-CSF, IL-4 nach Ficazzola and Taneja, 1998

  34. Klinische Studien (NIH approved) I Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen Immuntherapie Tumorvaccine Gansbacher Retrovirus: IL-2 ex vivoTumorvaccineSimons Retrovirus: GM-CSF Tumorvaccine Paulson Liposome: IL-2 Immuntherapie systemisch Chen Vaccine: PSA in vivo systemisch Kufe Vaccine: PSA systemisch Sanda Vaccine: PSA intratumoral Simons Adenovirus: PSA intratumoral Belldegrun Liposome: IL-2 nach Ficazzola and Taneja, 1998

  35. Therapie Induzierung des Zelltodes Suizidgene:Cytosin-Desaminase (CD) Herpex-Simplex-Thymidin- Kinase (HSV-tk) Ganciclovir 5’-Fluorcytosin (5-FC) HSV-tk CD Ganciclovir- P 5’-Fluorouracil (5-FU) zelluläre Enzyme Ganciclovir- P-P-P

  36. Therapie Induzierung des Zelltodes durch HSV tk/GCV adenoviraler Vektor intraprostatische Injektion i. v. GCV HSV tk CMV Prom. klin. Phase I:18 Patienten nach Radiotherapie lokales Rezidiv, keine Metastasierung 4 ADV-Konzentrationen Ergebnis:PCR Nachweis des Vektors im Urin keine Wachstum des ADV in Blut- oder Urinproben 4 Patienten Grad 1-2 Toxizität 1 Patient Grad 3-4 Toxizität 3 Patienten mind. 50 % PSA-Abfall (6-52 Wochen) Herman et al., 1999

  37. Therapie Therapie mit Antisense-Oligonukleotiden Antisense- Oligonukleotid Translation X Amino säuren DNA mRNA Ribosom Protein

  38. Antisense-Behandlung von PCa-Zellen Verringerung der Viabilität von DU 145-Zellen nach Antisense-Telomerase-Behandlung 3 5 µM AtRT 10 µM AtRT 2,5 15 µM AtRT 2 Kontrolle 15 µM NS 1,5 • Viabilität 1 0,5 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Zeit (Tage) Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

  39. Expression von Tumorsuppressorgenen p53-Expression adenoviraler Vektor CMV Promotor p53 p 53 klin. Phase I/II: intraprostatische neoadjuvante Therapie 17 Patienten mit lokal fortgeschrittenem PCa 3 Injektionen (14 Tage Abstand) Ergebnis: keine Grad 3 und 4 toxischen Effekte 3/14 Patienten: 25% Reduzierung der Tumorgröße Logothetis et al., AUA 1999

  40. Klinische Studien (NIH approved) II Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen Suizidgen intratumoral Kadmon Adenovirus: HSV-tk intratumoral Scardino Adenovirus: HSV-tk intratumoral Hall Adenovirus: HSV-tk Tumorsuppressor intratumoral Belldegrun Adenovirus: p53 intratumoralLogethetis Adenovirus: p53 Anti-Oncogen intratumoral Steiner Retrovirus: Myc-antisense nach Ficazzola and Taneja, 1998

  41. Das urologische Forschungslabor Prof. Dr. M. P. Wirth Dr. Ulrike Fiedler Susanne Füssel Uta Schmidt Wibke Ehlers Dr. Andres Melchior Birgit Noack Ascan Schindler Jörg Stade Romy Kranz Jana Herrmann Silke Tomasetti

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