موضوع : كنترل كيفي آزمايشگاه ميكروب شناسي

2. موضوع : كنترل كيفي آزمايشگاه ميكروب شناسي

3. نکات عمومی در مورد محیط های کشت: آب: کیفیت محیط های کشت بطور مستقیم بستگی به کیفیت مواد خام مورد استفاده در تهیه آنها دارد. آب یکی از مهمترین موادی است که در تهیه محیط های کشت بکار میرود. سه معیار مهم برای آب مورد استفاده در تهیه محیط های كشت شامل وجود یونهای مس، قدرت هدایت الکتریکی و pH می باشد. در شرایط ایده آل یونهای مس بدليل خاصیت مهارکنندگی برای اغلب میکروارگانیسم ها نباید در آب مورد استفاده جهت تهیه محیط های کشت وجود داشته باشد. قدرت هدایت الکتریکی آب باید کمتر از 15 میکرو زیمنس باشد وهمچنینpH آب مورد استفاده بهتر است کمی اسیدی باشد ولی نباید کمتر از 5/5 باشد. تهيه و کنترل کیفیت محیط های کشت

4. طبق دستورالعمل تهيه محيط کشت که بر روي قوطي نصب گرديده است، مقدار مناسبي از پودر محيط کشت را با دقت وزن نماييد. ظرف محيط کشت را دور از کوران هوا و رطوبت باز کنيد. از استنشاق پودرها به خصوص آنهايي که داراي مواد سمي هستند و تماس طولاني مدت آنها با پوست اجتناب کنيد. پودر را به سرعت، به دقت و بدون ايجاد توده اي از غبار وزن کنيد. هرچه زودتر درب ظرف را ببنديد. نصف حجم آب مورد نياز را داخل ظرف بريزيد. سپس مقدار وزن شده محيط کشت را به آن اضافه نماييد. براي چند دقيقه به تندي تکان دهيد. باقيمانده آب را به ديواره ظرف بريزيد تا ذرات محيط کشت چسبيده به ديواره نيز وارد محلول شوند. اين مرحله بسيار مهم است، چون پودر خشک محيط کشت در بالاي سطح آب، ممکن است در اتوکلاو استريل نشود و منبع آلودگي گردد. توزين محيط کشت و افزودن آب:

5. محيط هاي کشت بدون آگار، معمولا با تکان دادن آهسته و ملايم حل خواهند شد. اما محيط هاي کشت حاوي آگار بايد قبل از حرارت دادن به مدت چند دقيقه با آب مخلوط شوند. سپس حرارت داده شوند تا آگار قبل از اتوکلاو کردن، حل شود. محيط هاي کشت را بجوشانيد بدون آنکه بسوزند. محيط هاي کشتي که نبايد اتوکلاو شوند، بعد از اين مقدار حرارت دادن، براي تقسيم داخل پليت ها يا ظروف ديگر آماده خواهند بود. اکثر محيط هاي کشت به استريليزاسيون نهايي (در دماي C °121 به مدت 15 دقيقه) نياز خواهند داشت. حل کردن محيط کشت:

6. محيط هاي کشت دهيدراته اگر بطور مناسب تهيه شوند نيازي به تنظيم pH ندارند.pH نهايي محصول استريل شده را مي توان روي پليت يا بطري اندازه گيري کرد، اما بايد آنها را بعد از سنجش pH دور ريخت. بنابراين بعد از استريل شدن و خنک شدن محيط کشت تا دماي C °25، مقدار pHرا در حد مورد نظر (2/0 ±) تنظيم نماييد. تنظيم pH معمولا با استفاده از هيدروکسيد سديم 40 گرم در ليتر (تقريبا" يک مولار) و يا با استفاده از اسيد کلريدريک 5/36 گرم در ليتر (تقريبا" يک مولار) انجام مي شود. اندازه گيري و تنظيم pH:

7. محيط کشت را در ظرفي مناسب با حجم 2 تا 3 برابر حجم محيط کشت بريزيد تا بتوانيد آنرا به خوبي تکان دهيد و مخلوط کنيد. توزيع:

8. بعضي از محيط هاي کشت به استريليزاسيون با اتوکلاو احتياجي نداشته و با جوشاندن استريل مي شوند که دستور ساخت آنها بر روي برچسب قوطي محيط کشت قيد گرديده است. استريليزاسيون ساير محيط هاي کشت توسط حرارت مرطوب يا صافي غشايي انجام مي گردد که اين موارد نيز بر روي بر چسب قوطي محيط کشت قيد گرديده است. استريليزاسيون:

9. الف) استريليزاسيون با حرارت مرطوب: استريليزاسيون محيط کشت تا حجم يک ليتر، در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه و در دماي C °121 (فشار 2/1 کيلوگرم بر سانتيمترمربع) انجام مي گيرد. براي حجم هاي بيشتر از يک ليتر بايد چرخه استريليزاسيون را بطور مناسب تغيير داد. اما چون اکثر مشکلات در استريليزاسيون محيط هاي کشت وقتي رخ ميدهد که مقادير بيشتر از دو ليتر محيط کشت بايد استريل شود، لذا توصيه مي شود که مقادير زياد محيط کشت را در حجم هاي کوچکتر تقسيم نماييد.

10. کنترلی کیفی اتوکلاو کنترل دما و فشار اتوکلاو بایستی بطور مداوم انجام گردد. برای کنترل اتوکلاو از اندیکاتورهای شیمیائی TST استفاده می کنند. از اندیکاتورهای بیولوژیکی که جهت کنترل کارائی اتوکلاو استفاده می کنند اسپور Bacillus Stearothermophilus را می توان نام برد که بصورت تجاری قابل دسترس می باشد.

11. از صافي غشايي براي استريل کردن محيط هاي کشت و ترکيبات حساس به حرارت استفاده مي شود. استريليزاسيون بوسيله صافي غشايي تحت شرايط خلاء يا افزايش فشار انجام مي پذيرد. از غشاء ها و صافيهاي با قطر منفذ 22/0 يا 45/0 ميکرومتر استفاده نماييد. اين فيلترها بايد قبل از استفاده، در اتوکلاو استريل شوند. در مورد غشاء ها و صافيهايي که در بسته بنديهاي استريل به فروش مي رسند، به دستورالعمل سازنده مراجعه نماييد. قسمت هاي مختلف دستگاه صافي را با صافي يا بدون صافي در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه در دماي C °121 استريل نماييد. ب) استريليزاسيون با صافي غشايي:

12. بعد از استريليزاسيون، اجازه دهيد دماي محيط کشت به حدود C °50 برسد، سپس با رعايت شرايط آسپتيک در ظروف نهايي تقسيم نماييد. هيچ وقت محيط کشت را در دماي بالاتر از C °50 تقسيم نکنيد. مکمل هاي حساس به گرما و حرارت بايد بعد از اين که دماي محيط کشت به حدود C °50 رسيد، به آن اضافه شوند. اجازه دهيد دماي مکمل (ساپلمنت) استريل قبل از اين که به محيط کشت اضافه شود، به دماي اتاق برسد. سپس مکمل را با رعايت شرايط آسپتيک به محيط کشت اضافه نموده، خوب مخلوط کنيد و در ظروف نهايي که از قبل استريل شده اند، تقسيم نماييد. آماده سازي جهت مصرف:

13. کیفیت پتری دیش های مورد استفاده در تهیه محیط نیز اهمیت دارد. معمولاً پتری دیش ها را را با اتیلن اکساید ویا اشعه گاما استریل می کنند. در صورت استفاده از پتری دیش هایی که با اتیلن اکساید استریل شده باشند بایستی از نظر وجود بقاياي این ماده بررسی شود زیرا اتیلن اکساید دارای خاصیت مهار کنندگی برای میکروارگانیسم ها می باشد و می توان آن را با روش کروماتوگرافی اندازه گرفت. در صورت استفاده از پتری دیش های شیشه ای بایستی از پتری دیش هایي از جنس بروسيلیکات استفاده کرد. استفاده از پتری دیش هایي از جنس قلیائی ممکن است موجب آزاد سازی قلیا در داخل محیط کشت گردد. پتری دیش:

14. محیط کشت های تهیه شده باید قبل از استفاده، از لحاظ فیزیکی و ظاهری نيز بررسی شوند. معیارهای ظاهری قابل بررسی شامل وجود حباب، حفره، ناصافی سطح محیط، ترک خوردگی، یخ زدگی می باشد. ضخامت محیط نیز اهمیت دارد. ضخامت محیط های کشت پلیتی نبايد كمتر از 3 میلی متر باشد. پارامترهای فیزیکی:

15. پیتون= g5 Beef Extract = g 3 ژلاتین= g 120 مقادیر فوق را به cc1000 آب‌ مقطر اضافه کرده و در بن ماری جوش قرار دهید تا کاملاً حل شوند (از حرارت دادن این محیط کشت بر روی شعله پرهیز کنید). سپس در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و دمای oC121 در فشار 15 پوند ( Lb15) استریل ‌نمایید. سپس در لوله تقسیم کرده و PH محیط کشت را به 8/6 برسانید روش تهيه برخي محيط هاي كشتروش تهیه محیط کشت ژلاتین (ترکیبی)

16. پیتون= g10 کلرور سدیم (Nacl)= g10 آب‌مقطر=cc 1000 سپس pH را به 9-6/8 برسانید و در شرایط 15 دقیقه, فشار Lb 15 در اتوکلاو قرار داده و استریل نمایید. دما نیز oC121 است. ( برای تنظیم از سودN 1 استفاده کنید) روش تهیه محیط کشت آب پپتونه قلیایی یا APW (ترکیبی)

17. محیط پایه همان محیط برین هارت اینفیوژن براث/آگار است. از آنجا که این محیط کشت حاوی 5/0% نمک می‌باشد، بنابراین 6% نمک به این محیط پایه اضافه نمایید تا مقدار 5/6% نمک حاصل شود. شرایط استریلیزاسیون همان دمایoC121، فشار Lb15 و زمان 15 دقیقه می‌باشد. براساس دستور ساختی که روی هر بسته محیط کشت قید شده پودر بلادآگار را وزن نموده و در مقدار مشخص آب مقطر بریزید پس از حرارت دادن و ذوب کامل پودر آن را در 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه اتوکلاو نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سردشدن تا دمای 500C تا 550C حدود 10 درصد خون گوسفند اضافه نماید و پس از مخلوط کردن به آرامی داخل پتری دیش ازمایشگاهی تقسیم کنید. و بگذارید سرد شود. اگر قصد ساختن آگار شکلاتی ChoColate Ajar را دارید پس از افزودن خون به بلاد آگار آن را در دمای 75 تا 80 درجه قرار دهید تا محیط آگار شکلاتی داشته باشید. روش تهیه محیط کشت NaCl5/6% (براث/ آگار)

18. این محیط کشت در اصل برای جداسازی گونه نیسریابی بیماری زا فرموله شد. امروزه بیشتر در ارتباط با دیسک‌های آنتی بیوتیکی با توان بالا برای تعیین الگوهای حساسیت آنتی بیوتیکی بکار می‌رود. روش ساخت آن بسیار ساده است پس از وزن مقدار مشخص از پودر آن را در آب مقطر استریل و در روی شعله حرارت داده تا پودر کاملاً حل شود سپس در اتوکلاو 121 درجه سانتیگراد برای 15 دقیقه استریل نمایئد پس از خروج از اتوکلاو و سرد شدن تا 50 درجه سانتیگراد آن را در ظروف پتری دیش تقسیم کنید ضخامت محیط کشت از چهار میلیمتر بیشتر نگردد. Mueller Hinton Agar محیط مولر هینتون آگار

19. این محیط برای کشت انتروباکتریاسه مفید است و محتوی نمک صفراوی است تا باکتری‌های غیر روده‌ای را مهار کند و نیز برای تشخیص کلی فرم‌های تخمیر کننده لاکتوز از سالمونلاهای غیر تخیمرکننده لاکتوز و گروه دیسانتری، حاوی لاکتوز یا قرمز خنثی (Neutra red )است. محیط Macconkey Agar

20. بیسموت سولفیت آگار مناسب برای جداسازی سالموفلاتایفی و دیگر بایسل‌های روده‌ای است روش ساخت آن مطابق دستور الصاقی روی ظرف میحط کشت است. بیسموت سولفیت آگار یک محیط کاملاً مغذی به علت وجود پپتون‌ها، عصاره گوشت گاو و دکستروز است. سولفات فروز، معرف تولید سولفیدهیدروژن است بیسموت فلز سنگینی است که خاصیت مهار کنندگی بعضی از میکرو ارگانیسم‌ها را دارد رنگ بریلیانت گرین نیز به عنوان مهار کننده است حضور این مهار کننده‌ها باعث مهار باکتر‌ی‌های گرم مثبت و بیشتر ارگانیسم‌های گرم منفی روده‌ای به جز اکثر گونه‌های سالمونلا و بعضی از گونه‌های شیگلا می‌شود. ممکن است گونه سالمونلا براساس ظاهر و رنگ کلونی احتمالی شنساسایی گردد. رنگ سیاه یا سبز ایجاد شده، یک رسوب فلزی است که وقتی سولفید هیدروژن (که توسط سالمونلا از ترکیبات سولفور در میحط ایجاد شده) با یک نمک آهن واکنش بدهد، تولید می‌شود. به طور شاخص کلونی ها سیاه یا سبز هستند و ممکن است با هاله سیاه یا قهوه‌ای تیره با درخشندگی فلزی سبز احاطه شده باشند. Bismuth Sulfite Ajar

21. ظاهر کلونی‌های شاخصی (Typic) و واکنش آنها روی بیسموت سولفیت آگار به شرح زیر است : Salmonella typhi : کلونی‌های مسطح، خشک، سیاه مرمری احاطه شده با هاله‌های سیاه مایل به قهوه‌ای در محیط معمولاً درخشندگی فلزی وجود دارد. Salmonllatyphi : کلونی‌های سیاه مرطوب، بدون هاله S Paratyphi – S. Cholerasuis – S.gallinanum – morganellamorganij کلونی‌ سبزبدون هاله Shigellaspp مهار می‌شود، اما اگر رشد کند، کلونی‌های سبز مایل به قهوه‌ای دارد این محیط کشت احتیاج به اتوکلاو ندارد.

22. این محیط برای جمع‌آوری و حمل نمونه‌های بالینی به کار می‌رود. در سال 1964 Cary and Blair فرمول جدیدی را شرح دادند که برای انتقال نمونه‌های مدفوع درست شده بود. محیط آنها حاوی مقدار ماده‌ مغذی کم، پتانسیل اکسید و احیاء پائین و PH بالا بود Cary و همکارانش روی بقاشیگلا و سالمونلا در این محیط تحقیق کردند. در بررسی 162 نمونه مدفوع، ارگانیسم های شیگلا برای 49 روز قابل جداسازی بودند سالمونلاها برای 45 روز در پی تلقیح سازی وقتی آلوده کننده‌های پروتئوسی و سودوموناسی وجود داشتند و برای 62 روز در غیاب این آلوده کننده‌ها، قابل جداسازی بودند. محیط Cary and Blair Transport medium

23. Gaines و همکارانش یک سلسله آزمایش روی Cary and Blair Transport medium برای جمع‌آوری نمونه‌های مدفوع یا رکتال سواب در منطقه‌ای از تایلند که اسهال اندمیک بود انجام دادند آنها نتیجه‌گیری کردند که این محیط کشت روشی کارا و موثر را برای انتقال نمونه‌های مدفوع فراهم می‌کند.این محیط با حداقل مواد مغذی، فرموله شده تا بقای ارگانیسم را بدون پاسخ و دفاع افزایش دهد. تایوگلیکولات سدیم اضافه می‌شود تا پتانسیل اکسید و احیای پائینی را فراهم کند، PH نسبتاً بالا نابودی باکتری‌ها به علت تشکیل اسید را کاهش می‌دهد. سواب‌های فرو رفته در مدفوع یا نمونه‌های دیگر را داخل لوله‌های محتوی محیط ترانسپورت (انتقالی) قرار دهید. لوله‌ها در طی حمل به آزمایشگاه در دمای اتاق نگهداری می شوند به محض رسیدن لوله‌ها به آزمایشگاه باید از سواب‌های برای تلقیح محیط‌های مغذی استفاده کرد. محیط کری بلر را پس از آماده سازی تا یک سال در دمای اتاق می‌توان نگهداری کرد.

24. طول عمر محیط های کشت تهیه شده بستگی به نوع اجزاء تشکیل دهنده محیط، نحوه نگهداری و ذخيره کردن آنها دارد. تمامی محیط های کشت باید دور از نور نگهداری شوند. تابش نور به محیط های کشت موجب تشکیل مواد باکتریوستاتیک و باکتریساید مانند پراکسیداز می گردد. طول عمر اغلب محیط های کشت پلیتي در دمای 4 درجه سانتیگراد یک هفته می باشد ولی اگر در داخل کیسه های پلاستیکی بسته بندی شوند بطوریکه هوا داخل آنها نفوذ نکند تا 4-3 هفته قابل مصرف هستند. طول عمر محیط های کشت حاوی آنتی بیوتیک بستگی به پایداری آنتی بیوتیک موجود در آن دارد. در مجموع محیط های حاوی آنتی بیوتیک را در مدت یک هفته باید مصرف کرد نگهداری محیط های کشت تهیه شده:

25. . از سوی دیگر با گذشت زمان اینگونه محیط های کشت رطوبت خود را از دست داده، بدلیل افزایش غلظت آنتی بیوتیک قدرت انتخابی آنها افزایش می یابد. پلیت ها را باید قبل از مصرف به دمای اتاق رساند. اگر پلیت محیط کشت بیش از 8 ساعت در دمای اتاق باقی بماند برای مصرف مناسب نمی باشد. محیط های کشت لوله اي در مقایسه با محیط های کشت پلیتی عمر طولانی تري دارند. اغلب این محیط های کشت اگر در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شوند 6-3 ماه قابل مصرف می باشند.

26. موارد استثناء: تايوگليكولات براث، اندول نيترات براث و SIM فقط به مدت يكماه قابل نگهداري مي باشند. محيط هاي CTA Medium و OF Medium حاوي كربوهيدرات و مولرهينتون براث فقط به مدت 6 هفته قابل نگهداري مي باشند.

28. اصطلاحات مربوط به سویه های میکروبی کنترل • سویه کنترل (Control Strain): میکروارگانیسمی که برای ارزیابی عملکرد میکروبی محیط کشت استفاده می شود. • سویه مرجع (Reference Strain): میکروارگانیسمی که حداقل تا سطح جنس و گونه شناسایی شده و بر اساس ویژگی ها و ترجیحاً منشا آن، فهرست بندی و تعریف شده است. • ذخیره های مرجع (Reference Stocks): کشت های بدست آمده از پاساژ سویه مرجعی که از مراکز بین المللی تهیه شده است. • ذخیره های کاری (Working Stocks): کشت مجددی که از کشت های ذخیره جهت کنترل کیفیت محیط های کشت استفاده می شود. کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی:

29. .(American type culture collection) این سوشها، حداقل سوشهایی هستند که باید برای ارزیابی هر محیط کشت استفاده شوند. ارگانیسم های مورد استفاده برای اهداف کنترل کیفی مي تواند از سویه های National collection باشد. سویه های دیگری نیز ممکن است توسط سازنده محیط کشت به کار رود که شامل مجموعه ای از سویه های وحشی (Wild strain) یا بدست آمده از نمونه های بیمار می باشد که مختص هر آزمایشگاه بوده و برای انجام آزمایش هاي بیشتر به کار می روند. منبع سویه های کنترل:

30. یک کشت از ارگانیسم کنترل کیفی روی پلیت بلادآگار تهیه کنید. بعد از انکوباسیون پلیت 5-3 کلنی ایزوله را در مقدار کمی تریپتیکیس سوی براث (TSB) استریل حل نمایید تا سوسپانسیون میکروبی حاصل شود و آن را برای چهار یا پنج ساعت انکوبه نمایید. سپس کدورت آن را با استاندارد نیم مک فارلند تنظیم کنید. (استاندارد نیم مک فارلند در طول موج 625 nm، دارای جذب 08/0 تا 1/0 ناتومتر می باشد) روش انجام آزمون کنترل کیفیت محیط های کشتتهیه سوسپانسیون میکروبی:

31. به جای این روش می توان مستقیماً از کلنی های ایزوله روي پليت، سوسپانسیون میکروبی مطابق با كدورت نيم مك فارلند تهيه كرد. بدين ترتيب كه 5-3 کلنی ایزوله روی پلیت 24 ساعته را در 5-3 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل كرده و کدورت آن را با نیم مک فارلند تنظیم نماييد. با هر روشی که این سوسپانسیون ميكروبي تهیه شود، باید كدورتي حاوی 107-108 CFU/ml کلنی داشته باشد. (مطابق با استاندارد نیم مک فارلند).

32. 1- آزمایش ظرفیت مغذی بودن (Nutritional activity) محیط هاي کشت پلیتی مانند بلاد آگار سوسپانسیون اولیه را به نسبت 1 به 100 در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ 10 یا ml 01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح كنيد. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 104-103 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون را ده بار رقیق تر تهیه نماييد. بررسی آزمایش هاي عملکردی محیط کشت (Performance testing)

33. 2- آزمايش ظرفیت مهار کنندگی محیط های کشت انتخابیپليتيمانند مكانكي آگار سوسپانسیون اولیه را به نسبت 1 به 10 در نرمال سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار lµ 10 یا ml01/0 سوسپانسیون رقیق شده را به محیط کشت مورد آزمایش تلقیح کنید. تعداد کلنی های مورد انتظار در هر پلیت (CFU/plate) 105-104 می باشد. برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون ده بار رقیق تر تهیه شود.

34. 3- آزمایش محیط های کشت لوله ای هر لوله باید با lµ 10 یا ml01/0 از سوسپانسیون اولیه تهيه شده مطابق با نیم مک فارلند (بدون رقيق سازي) تلقیح شود. گاهی ممکن است به تلقیح کمتر یا بیشتر نیاز باشد. محیط مورد آزمون را بعد از تلقیح تحت شرایطی که در جدول 2 آمده است، انکوبه نمایید. به طور نرمال زمان انکوباسیون، 24-18 ساعت یا 48-24 ساعت در دمای Cº 2±35 می باشد. محيط شکلات آگار و ساير محیط های کشت برای جداسازی انتخابی گونه های نیسریای بیماریزا باید در 10- 5% Co2 انکوبه شوند و در فواصل زماني24-18 ساعت وسپس 48-24 ساعت بررسی گردند. برای باكتري هاي بی هوازی، کشتها عموماً به حداقل 48 ساعت انکوباسیون در شرایط بی هوازی و غنی از Co2 نیاز دارند. در مورد کمپیلوباکتر آگار، پلیتها باید در Cº 42 در شرایط میکروآئروفیلیک غنی از Co2 به مدت 48 ساعت انکوبه شوند.

35. 4- کنترل محیط های کشت براي آزمایشهاي بیوشیمیایی از سوسپانسیون میکروبی رقیق نشده برای كنترل این محیطها استفاده می کنیم. پس از تلقیح، تمام کشت ها را در شرایط لازم (از نظر Co2، رطوبت و یا شرایط بیهوازی و درجه حرارت مناسب) قرار داده و پس از طی مدت زمان لازم (24 تا 48 ساعت) آنها را مورد بررسی قرار می دهیم. محیط های مناسب دارای رشد كافي از کلنی های باکتریهاي مورد نظر مي باشند و در مورد محیطهای انتخابی مهار میکروارگانیسمهای مورد نظر بايد مشخص باشد.

36. رطوبت: محیطهای کشت باید بدون هر گونه رطوبت اضافی بوده، همچنین هیچ نشانه ای از خشک شدن اطراف محیط کشت نبايد مشاهده گردد. • سترون بودن: محیطهای کشت باید عاري ازآلودگی باشند. رنگ: محیطهای کشت آگار خوندار نباید هیچ نشانه ای از همولیز داشته باشند و محیطهای کشت دیگر نباید هیچگونه تغییر رنگ غیر طبیعی داشته باشند. کنترل محیط های ساخته شده تجاری (آماده مصرف):

37. در صورتیکه تعداد پلیت یا لوله تهیه شده در هر سری ساخت یا Lot، 100 عدد یا کمتر باشد، باید به تعداد 5-3% محیط هاي تهیه شده را در دماي Cº 37-35 به مدت 5-2 روز انکوبه نمود. برای Lot های با تعداد بيش از 100، باید به تعداد 10 پلیت یا لوله را به طور تصادفی برداشته و در شرایط فوق انکوبه نمود. بعد از انکوباسیون هیچ گونه رشد میکروبی نباید مشاهده شود. بررسی آلودگی محیط های کشت (استریل بودن محیط های کشت):

38. یک محیط کشت زمانی قابل قبول می باشد که با همه سویه های پیشنهادی برای آزمون محیط کشت که در جدول 2 مشخص شده است، رشد کافی داشته و خصوصیات مورفولوژیكي کلنی ها بارز باشد. در مورد محیط های انتخابی، رشد بعضی از ارگانیسم های خاص مهار می شود، ضمن اینکه اجازه رشد کافی به سايرارگانیسم می دهد. در بعضی موارد، واکنشهای رنگی خاص یا همولیز همچنانکه در جدول 2 آمده است، باید ایجاد شود. مثلاً در مورد کشت بلادآگار ایجاد همولیز مناسب ضروری است و یا برای محیط مکانکی آگار ایجاد واکنش های رنگی برای سویه های میکروبی مشخص ضروری می باشد.

39. محیطهای کشت آماده مصرف باید از نظرموارد زیر نيز بررسی شوند: • شکستگی ظروف پتری • پر شدن ناصاف پلیتها • ترک خوردگی محیط کشت در پلیتها • وجود همولیز (برای بلاد آگار) • یخ زدگی • وجود مقدار زیاد حباب یا حفره در سطح محیط كشت سایر معیارهای تضمین کیفیت:

40. جدول 2- كنترل كيفي محيط هاي كشت متداول

42. ديسك‌ها بايد در دمای-8 تا -14 درجه سانتیگراد نگهداري شوند. تمامي ديسك‌هاي آنتی‌بیوتیکی گروه بتالاكتام مانند پني‌سيلين، آمپي‌سيلين، كربني‌سيلين، تيكارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين‌ها و... بايد در فريزر نگهداري شوند و فقط مي‌توان مقداري از آن را بر اساس كار روزانه آزمايشگاه حداكثر به مدت يك هفته در يخچال معمولی نگهداري نمود. ديسك‌ها بايد در ظروف داراي درپوش محكم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند. ديسك‌هاي آنتي‌بيوتيكي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند. نگهداري ديسك‌هاي آنتي بيوتيكي

43. سويه هاي کنترل کيفي  را بايد به روش استاندارد آزمايش  disk diffusionو با استفاده از همان مواد و روشي که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلينيکي استفاده مي شود  آزمايش و نتايج را با جداول CLSI  مقايسه و بررسي نمود . محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک ديسک آنتي بيوتيکي در جداول فوق فهرست شده است . چنانچه تغيير در ميانگين قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا در روش انجام آزمايش نباشد ، احتمالا" ناشي از تغيير در حساسيت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بيوتيک مي باشد. در اين صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهيه شود . کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي

44. الف _ انجام آزمايش روزانه       براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بيوتيکي بايد 20 روز متوالي آزمايش تعيين حساسيت انجام و نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق مقايسه گردد . بر اساس ضريب اطمينان 95% تنها يک مورد از 20 نتيجه قرائت شده مي تواند خارج از محدوده كنترل باشد ( به ضميمه 2مراجعه کنيد) . چنانچه بيشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل باشد نياز به اقدامات اصلاحي خواهد بود ، که در ادامه توضيح داده مي شود. آزمايش کنترل کيفيت  را بايد درچه فواصل زماني انجام داد ؟

45. ب _ انجام آزمايش هفتگي - در صورتيكه تنها يک مورد از 20 نتيجه  قطر هاله عدم رشد براي هر سويه کنترلي/ ديسک آنتي بيوتيکي خارج از محدوده قابل قبول مندرج در جداول 3 و A3( ضميمه 3) قرار گيرد ، کنترل کيفي روزانه را به هفتگي تغيير دهيد( به ضميمه 2 مراجعه کنيد) . - آزمايش کنترل کيفي هفتگي را يکبار در هفته و هم چنين زمانيکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت آگار يا ديسکهای تهيه شده از يک سازنده) تغيير کند، انجام دهيد . اگر هر يک از نتايج کنترل کيفي هفتگي خارج از محدوده قابل قبول باشد ، انجام اقدامات اصلاحي مورد نياز است .

46. براي نگهداري سويه‌هاي باکتريايي مي‌توان از دو روش استفاده نمود. روش طولاني مدت روش کوتاه مدت نگهداري و استفاده از سويه‌هاي باکتريايي

47. نگهداري طولاني مدت نگهداري طولاني‌مدت باکتريها اين امکان را مي‌دهد که کليه سويه‌هاي ميکروبي اعم از هوازي (بارشد سريع ويا سخت رشد) ونيز بيهوازي ، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند. بهترين روشهاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتي‌گراد يا پايين تر ( در ديپ فريز يا در نيتروژن مايع ) مي‌باشد.

48. 1- نگهداري در ديپ فريز ( 50- تا 70- درجه سانتي‌گراد يا پايينتر) ويا نيتروژن مايع : باکتري مورد نظر را روي محيط مغذي مانند پليت TSA ( Trypticase Soy Agar ) حاوي 5% خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط آگار شکلاته کشت دهيد. پليتها را به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه سانتي‌گراد و در صورت نياز تحت شرايط CO2 براي هر باکتري انکوبه نمائيد.

49. بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مورفولوژي کلني‌ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تستهاي بيوشيميايي آنرا انجام دهيد. سپس از باکتري رشد يافته ، سوسپانسيون غليظي در 100-50 ميلي‌ليتر از يک محيط محافظت‌کننده از سرما (Cryoprotective ) تهيه نمائيد. اين محيط براي جلوگيري از تخريب سلولهاي باکتري در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي‌گيرد. محيط محافظت‌کننده از سرما مي‌تواند Skim milk ، خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه استريل يا Tryptic Soy Broth (TSB) حاوي گليسرول با غلظت نهايي 15-10% باشد. سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدارmL1- 5/0 در ويالهاي شيشه‌اي يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد . تعداد ويال ذخيره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائيد.

50. سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس انفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در فريزر 70- درجه نگهداري شوند. سويه‌هاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد زيادتري از آنها از بين مي‌روند. بنابراين توصيه مي‌شود براي اطمينان از حيات سويه‌ها هر چند ماه ، طبق روش زير کشت داده شوند. يک ويال از فريزر بيرون آورده و و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد. نمونه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت 24-18 ساعت در دماي 2±35 درجه ودر صورت نياز در شرايط CO2 انکوبه نماييد. اين باکتري مي‌تواند براي آزمايشهاي کنترل داخلي کيفيت در آزمايشگاه يا براي تهيه working control بکار رود. قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن نمونه ، اطمينان حاصل کرد. ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده و بهيچوجه مجددا فريز نگردد.