ÇIKAR İLİŞKİSİ YOKTUR

1. MEZENKİMAL KÖK HÜCRE UYGULAMASI FARELERDE OLUŞTURULAN KRONİK ASTIM MODELİNDE AKCİĞER HİSTOPATOLOJİK BULGULARI HAFİFLETMEKTEDİR Fatih Fırıncı1, Meral Karaman2, Yusuf Baran3, Alper Bağrıyanık4, Zeynep Ayyıldız1, Müge Kıray4, İlknur Kozanoğlu5,Osman Yılmaz2, Nevin Uzuner1, Özkan Karaman1 1 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Allerji-Solunum Birimi 2 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mulltidisipliner Laboratuvarı 3 İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü 4 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı 5 Başkent Üniversitesi Adana Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kemik iliği Nakil Bölümü ÇIKAR İLİŞKİSİ YOKTUR

2. Kemik iliği stroması, hematopoietik kök hücreler dışında mezenkimal kök hücreler (MKH) olarak bilinen bir hücre grubunu da içermekte • Bu hücreler kemik, kıkırdak, yağ, tendon, kas gibi farklı mezenkimal dokulara in vitro veya in vivo farklılaşabilen multipotent öncül hücrelerdendir

3. Kemik iliği hücrelerinin yaklaşık %0.01 ile %0.001’ini oluşturan bu hücreler, cam ve plastiğe yapıştıkları için hematopoietik kök hücrelerinden kolaylıkla ayrılabilirler • Ayrıca MKH kemik iliğinden izole edildikten sonra in vitro koşullarda çoğaltılabilmekte • Bu hücreler, spesifik hücre tiplerine farklılaştırıldıktan sonra çeşitli sistemik ve lokal hastalıkların tedavilerinde kullanılmakta

4. Donör MKH’inin transplant sonrası alıcıda • kardiyak myoblast, • hepatik epitelyal • nöroektodermal hücrelere farklılaşabileceği

7. Aynı zamanda mezenkimal kök hücrelerin anti-inflamatuar özellikleri de bulunmakta Expert Opin Biol Ther. 2008 May;8(5):569-81 Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies. Iyer SS, Rojas M. Nutrition and Health Sciences Program, Atlanta, GA 30322, USA.

8. AMAÇ • Farelerde deneysel olarak oluşturulan kronik astım modelinde MKH’lerinin akciğer histopatolojisi üzerine etkisini değerlendirmek

9. Yöntem • Deney hayvanları: • Erişkin 36 adet 20-25 gr ağırlığında dişi BALB/c türü fareler kullanıldı. • Astım modeli: • Temelkovski J ve ark. tarafından tanımlanan astım modeli yapıldı. Çalışma gruplarındaki farelere 0. ve 14. gün iki kez 10µg intraperitoneal ovalbumin uygulanarak duyarlılaştırıldı. • Kontrol grubundaki farelere aynı yol ve dozda salin solusyonu uygulandı. • Çalışma gruplarındaki farelere 21. günden başlamak üzere, günde 30 dakika süre ile haftanın üç günü, 8 hafta boyunca steril salin içindeki % 2.5’lik ovalbumin solusyonundan oluşan aerosol inhale ettirildi.

10. Temelkovski ve ark.’ları tarafından tanımlanan kronik astım modeli

11. Mezenkimal kök hücrelerin eldesi • BALB/c türü farelerin femurlarından kemik iliği örnekleri alındı. • Kemik iliği hücreleri DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) besi yeri ortamına ekildi. • MKH’inin yapışma özelliği olmasından dolayı yapışmayan kök hücreler besi ortamı yenilenerek ortamdan uzaklaştırıldı. • Yaklaşık 2 hafta sonra MKH yoğunluğu %80-90 oranına ulaştığında MKH ortamdan tripsin ve EDTA yardımı ile ayrıştırıldı.

12. Elde edilen hücrelerin flow sitometride CD105, CD73, NG2 eksprese ettikleri, hematopoietik marker olan CD45’i eksprese etmedikleri gösterildi. Böylece bu hücrelerin MKH olduklarını kesinleştirildi.

13. MKH green flouresan protein (GFP) ile işaretlendi. • Bu karışım 1 saat süre ile 37.5oC %5 CO2’de inkübe edildi. • Daha sonra yaklaşık 106 MKH 0,1 ml SF içerisinde farelerin kuyruk veninden verildi.

14. Çalışma Grupları: • 4 grup oluşturuldu. • Ayrıca çalışma grupları kendi içinde erken ve geç evre olmak üzere iki alt gruba ayrıldı. • Grup 1 (kontrol, n=6): Bu gruptaki farelere salin verildi. • Grup 2 (astım, n=10): Bu gruptaki farelere astım modeli oluşturulduktan sonra herhangi bir tedavi verilmedi. • Grup 3 (astım+MKH, n=10): Bu gruptaki farelere astım modeli oluşturulduktan sonra MKH verildi • Grup 4 (sadece MKH n=10): Bu gruptaki farelere ise astım modeli oluşturulmadan sadece MKH verildi

15. Çalışma Grupları • Grup 2, 3 ve 4’teki farelerin yarısı • Akciğer histopatolojisi değerlendirmek • MKH’lerin akciğere göçünü göstermek amaçlı • MKH uygulamasından 1 hafta sonra sakrifiye edildi. • Bu gruplardaki kalan diğer fareler MKH uygulamasından 2 hafta sonra sakrifiye edildi • akciğer histopatolojisi açısından değerlendirildi

17. Kronik astımda mevcut olan histopatolojik değişiklikler Goblet hücre hiperplazisi Subepitelyal fibrozis İntraepitelyal eozinofiller Epitelyal hipertrofi Plazma, T lenfosit ve mast hücre infiltrasyonu Artmış vaskülarite Düz kas hipertrofisi/hiperplazisi

18. Işık mikroskobik değerlendirmede; • Subepitelyal düz kas kalınlığı • Epitel kalınlığı • Mast hücre sayısı • Goblet hücre sayısı Elektron mikroskobik değerlendirmede; • Bazal membran kalınlığı ölçüldü. Konfokal mikroskobik değerlendirmede; • Green floreasan protein ile işaretlenen MKH’lerinin ışıması gözlendi

19. İstatistiksel analiz: • SPSS 11.0 programı kullanıldı. Histopatolojik parametrelerin karşılaştırılmasında ki-kare testi kullanıldı, p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

20. Bulgular • Histopatolojik inceleme sonuçları • 1. hafta sakrifikasyon sonuçları: • Grup 3’teki fareler Grup 2’deki fareler ile karşılaştırıldığında, epitel kalınlığı dışında diğer histolojik parametlerin anlamlı olarak düzeldiği saptandı • 2. hafta sakrifikasyon sonuçları: • Grup 3’teki fareler Grup 2’deki fareler ile karşılaştırıldığında tüm histolojik parametrelerin düzeldiği saptandı • Konfokal mikroskop sonuçları • Grup 4’teki farelerin akciğerlerinde anlamlı derecede MKH olmamasına karşın, Grup 3’deki tüm farelerin akciğer dokularında yeşil flurason eksprese eden işaretli MKH’ler saptandı • Bu durum işaretli MKH’lerin hasar görmüş inflame akciğer dokulara gittiğini göstermekte

22. * p<0,05 grupların erken evrelerinin karşılaştırılması # p< 0,05 grupların geç evrelerinin karşılaştırılması

25. Sonuç olarak • Çalışmamızda, farelerde oluşturulan kronik astım modelinde MKH’lerinin • İnflame olan akciğer dokusuna göç ettiği • Astımın histopatolojik bulgularını hafiflettiği

26. TEŞEKKÜRLER

29. İnsanlardaki hastalık sürecine benzerlikler açısından modellerKronik Allerjen Maruziyeti İnsan astımı ile benzerlikleri: • Yüksek Ig E düzeyleri • Th2 bağımlı allerjik inflamasyon • Havayolu mukozasına eozinofil göçü • Havayolu aşırı duyarlılığı • Havayolu remodelingi: Goblet hücre hiperplazisi Subepitelyal fibrozis Epitel hipertrofisi